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你应了解的知识-冷冻精液技术-生育能力保存
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你应了解的知识-冷冻精液技术

来源: 点击:0 发布时间:2016-01-29

精液的冷冻保存法

  人类精子保存是辅助生殖中的基本技术,由于低温生物学的发展,精子保存的方法不断更新;由于生殖医学的进步,满足临床工作需要的多种精子保存方法逐步出现。各种冷冻保存方法各有特点,但是理想的简便的冷冻保存方法还需进一步研究。

一、常规冷冻方法

  是形成最早的方法,也是目前使用最广泛的方法,它是随着低温冷冻学的基础理论的发展而发展。

1 、冷冻源

  生物体能在低温下长期保存,是因为低温能够抑制生物体的生化活动。这些生化活动大多数是由酶来催化而表现,服从于某些物理化学规律。根据细胞生物学理论,在-70e以上,细胞内某些酶还具有一定的活性,可以使细胞进行简单的、缓慢的代谢活动。著名的瑞典物理化学家Arrhenius研究温度对化学反应速率的公式可以推算出化学反应速率随温度降低而衰减的情况。例如:若生物体在4e能存活2小时,那么理论上,在-40e可以保存数日,在-80e可以保存数月,在-196e可以保存几个世纪[5]。Joseph Feldschuh报道了2例液氮低温冷冻保存了28年的精液仍然有生育能力[6]。因此无论是理论性还是实用性,-196e的液氮可以满足需要,也是目前精子库常用的低温保存的冷冻源。

2、冷冻保护剂

  1948年,Polge发现,冷冻精子时加入甘油可以对精子起到保护作用。这个发现有一定的偶然性,研究者准备是用果糖将鸡精液冻存,由于贴错了标签,误用甘油、白蛋白和水的混合物来冻存,结果发现果糖无效,而甘油混合物的效果非常好。刚开始,研究者们并不清楚混合物的具体成分,在分析化学家的帮助下,经过几次实验后确认甘油是最主要的成分,1949年,Polge等将他们的研究成果发表在5nature6杂志,这是低温生物学上里程碑式的文章,确立了甘油作为冷冻保护剂的主要地位,从此,低温生物学上崭新的一页揭开了,开始了生殖低温生物学的新纪元。虽然有渗透性(甘油、乙二醇、二甲亚砜)和非渗透性(氨基乙酸、蔗糖、乳糖)等多种保护剂,甘油仍然是人类精液冷冻保存首选的保护剂。一般分为单一甘油型、甘油复合型。甘油复合型冷冻保护液是以甘油为基础,加入蛋黄或白蛋白或蔗糖等高分子物质,以及两性离子缓冲系统,这是目前应用最为广泛和成熟的冷冻保护液。一般有3种,其一是Ackerman发明的甘油蛋黄柠檬酸保护液(glycerol-egg yolk-citrate,GEYC);其二是Mahadevan和Trounson发明的含甘油的Tyrodes改良液称作人精子保护液(human sperm preserving medium,HSPM);其三是Jeyendran等发明的含TES-TRIS缓冲系统、蛋黄、柠檬酸和甘油的保护液(TEST-yolk-glycerol,TYG)。较多研究工作比较了不同保护液的效果,但是由于精液检测的变异性和冷冻程序的不统一,严格意义上说并没有哪一种保护液是最好。但是,目前有TYG逐渐取代GEYC成为许多中心冷冻保存精子的趋势。保护液中的蛋黄能保护精子免受脂质物理状态的转化导致的冷休克损伤,由于蛋黄有传播疾病和致敏的可能性,人们希望能找到蛋黄的替代物,有研究报道在大豆中发现的卵磷脂中提取的磷脂有与蛋黄类似的效果。

3、 冷冻降温速率

  1940年,Luyet提出冰晶对细胞杀伤的冰晶理论。1972年,Mazur等首先从中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析中,提出了冷冻损伤的两因素假说。这个假说认为造成冷冻损伤有两个独立的因素:一个是/细胞内冰0的形成,这是过快冷却所产生的,冷却的速率越快,/细胞内冰0造成的冷冻损伤越大;另外一个是/溶质损伤0,或称/溶液损伤0,这是过慢冷却所造成的,过慢的冷却使细胞严重脱水,细胞处于高浓度的溶液中而受到损害,冷却速率越慢,损伤越大。由于此两因素的综合作用,必然存在一段平衡点,亦即存在着某一最佳冷却速率,该降温速率足以防止胞内冰形成,同时使/溶液损伤0效应最小,这就是低温生物学上著名的细胞存活率与降温速率之间的倒/U0形曲线。由于程序降温仪能够精确地控制降温速率,使用程序降温仪进行精液冷冻在临床上已经占据主导地位。同样基于上述原因,目前仍然没有/标准的0/理想的0降温程序,每一个生殖中心和精子库使用的都是适合自己实验室的降温程序。目前常规冷冻保存方法的技术改进主要集中于寻找最有效的冷冻保护剂和最佳的冷冻速率。

二、 玻璃化冷冻保存法

   液体转变成固体有两种形式,一种是常见的晶体,一种是非晶体。玻璃化是指液体转变为非晶体(玻璃态)的固化过程,它和常见的液体转变为晶体或部分晶体的固体的冻结过程不同,玻璃态固体分子之间的关系与原来液态分子之间的关系比较无明显改变,而一般晶体分子之间的关系与原来液态分子之间比较有明显区别。玻璃化比一般冻结固化方法引起的结构变化要小,是一种比较理想的低温保存方法。玻璃态物质与液态物质同属于/近程有序,远程无序0的结构,而且比液体/近程有序0程度更高。使溶液玻璃化途径有两个:一个是极大的提高冷却速率;另外一个是增加溶液浓度。常规玻璃化方法需要高浓度的保护剂,但是,由于精子细胞膜的渗透性,常规玻璃化冷冻精子的复苏率极低甚至为0。因此更多目光关注胚胎和卵子的玻璃化冷冻,精子的玻璃化冷冻陷入停滞。由于ICSI辅助生殖技术的发展,使得男性的微量精子就可以完成辅助生殖,特别是附睾或睾丸精子穿刺抽吸技术的使用,大大提高了梗阻性无精症不育患者的治疗效果。但是,此类患者的微量精子有数量少、发育不成熟等特点,如果采用常规冷冻保存方法,有回收率低、精子损伤严重等风险,由于玻璃化冷冻存在诸多优势:冷冻过程快速, 无需长时间的预平衡、逐步降温过程,数分钟就可以完成降温过程,无需昂贵的程序降温仪,液氮消耗少,无细胞内外的冰晶形成减少了细胞的损伤等优点,因此有学者开始关注玻璃化方法保存精液的研究。2002年,Nawroth首次报道精子无保护剂玻璃化冷冻获得成功。其后其他学者大量的研究认为:只要找到体积足够小的载体来实现极高的冻融速率,可以在不添加冷冻保护剂的情况下实现溶质的玻璃化,同时也避免了保护剂的化学毒性,微型载体的玻璃化冷冻方法比常规玻璃化冷冻方法有更大的优势。Isachenko的研究小组用5mm的铜环作为微型载体进行精子玻璃化冷冻实验,结果显示保护剂的玻璃化冷冻方法优于无保护剂的玻璃化冷冻方法,但是,与常规慢速冷冻方法比较,精子活动率无统计学差异。

三、冷冻干燥保存法

   冷冻干燥技术是将富含水物质在低温下冻结,然后在真空条件下通过对冻干物料的加热,使冰升华;再在真空条件下加热,除去吸附水,得到干燥的制品。在日常生活中,咖啡、牛奶、蔬菜的冷冻干燥是比较成熟和应用广泛的技术。人细胞的冷冻干燥,例如:红细胞、血小板等,可望给临床医学带来新的变革,是目前国际学术界十分关心和积极研究的问题,处于探索阶段。冷冻干燥法由于样品能够在4e下或常温下长期保存,不需液氮和低温装置,便于运输,因此在精子冷冻保存中也成为一个热点,在动物尤其是牛精子中取得了很大进展,在人精子的研究中也随之深入。由于冷冻干燥后,精子相当于已经/死亡0,即使复温后加入液体,粉末状的精子可以溶解于液体中,可以恢复其细胞外形,但是已经没有活动能力,通常用来评价精子的基本指标,例如活动率等,已经无法使用。那么,这些精子能够利用的就是其携带遗传物质的细胞核,通过辅助生殖技术的ICSI技术,将核注入卵母细胞,检测精子的受孕能力。在动物精子研究方面有很多文献,尤其是小鼠和牛,基于伦理学因素,用人类的卵母细胞进行试验并没有相关报道。目前研究只是集中于干燥冷冻后对人类精子遗传物质的影响。Kusakabe研究了将冷冻干燥后的人类精子注射入小鼠卵母细胞,结果提示冷冻干燥后的人类精子能够很好地维持染色体的完整性。